Resumo

A produção de proteínas recombinantes requer bactérias hospedeiras e plasmídeos como principais ferramentas. Uma das estratégias utilizadas na seleção de bactérias recombinantes é a inserção de genes de resistência a antibióticos, sendo o que codifica a Beta- lactamase o mais utilizado. O monitoramento do descarte de bactérias portadoras de plasmídeos ou outros organismos geneticamente modificados (OGM) no ambiente é uma medida ecológica e sanitária prevista em lei. Metodologias que permitam a detecção de hospedeiras e seus plasmídeos abrem uma perspectiva para o rastreamento da disseminação destes fatores em estações de tratamento de efluentes (ETE) e outros ambientes. O objetivo deste trabalho foi otimizar uma metodologia para detecção de genes de resistência a ampicilina e marcadores de K12 em E.coli W3110 transformada com o plasmídeo pUC18. Foram desenhados oligonucleotídeos (K12 L e K12R) para detecção de uma mutação no gene que codifica a Ramnose Trasnferase (rfb50) em cepas derivadas de E.coli K12. Para a detecção do gene de resistência a ampicilina foram desenhados oligonucleotídeos (BlaR e BlaF) específicos a uma região correspondente ao gene BLA presente no plasmídeo pUC 18. Colônias de E.coli K12 W3110 transformadas e Bacillus subtilis ATCC 6633 crescidas em placas de ágar triptcaseina (AST) foram submetidas a PCR (reação em cadeia da polimerase) multiplex para amplificação das regiões a serem pesquisadas. Os amplicons foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 2% e fotodocumentados. A PCR com oligonucleotídeos K12L/K12R e BlaR/BlaF amplificaram respectivamente os fragmentos esperados de 1690 e 186 pares de bases correspondentes a mutação rfb50 e gene Bla em amostras de E.coli 12 W3110. Amostras de Bacillus subtilis utilizadas como controle negativo, não amplificaram as regiões supracitadas. A metodologia molecular otimizada neste trabalho está sendo utilizada em amostras de ETE como medida de avaliação do sistema de contenção de vazamento de OGM para o meio ambiente. Além disso, pretende-se iniciar a validação de um kit molecular para rápida detecção da presença de OGM e seus derivados em ETE.