Resumo

O botulismo é uma doença paralítica fatal causada por neurotoxinas produzidas pela bactéria Clostridium botulinum que agem inibindo a liberação de acetilcolina na junção neuromuscular. As neurotoxinas botulínicas (BoNTs) são divididas em sete sorotipos (A-G) distintos, sendo os sorotipos C e D causadores da doença em bovinos no Brasil. Elas são compostas pelos domínios catalítico, de translocação e de ligação, sendo este último o fragmento C-terminal da cadeia pesada (Hc), que é atóxico. A vacinação é a melhor forma de prevenção da doença, porém a vacina disponibilizada no mercado é composta por toxoide inativado com formalina, a qual possui produção laboriosa e perigosa. Portanto, se faz necessário o desenvolvimento de vacinas recombinantes visando eliminar essas limitações. O objetivo do presente trabalho foi expressar e caracterizar o fragmento Hc das BoNTs C e D visando o desenvolvimento de uma vacina de subunidade recombinante para o controle do botulismo bovino. Genes sintéticos que codificam a região Hc das BoNTs C e D foram desenhados com códons preferencias de Escherichia coli e clonados no vetor de expressão pAE, que fusiona 6 resíduos de His à proteína heteróloga, facilitando a sua identificação e purificação. E. coli BL21 (DE3) Star foi transformada com os vetores recombinantes mediante choque térmico. Um clone de cada construção (pAE/c e pAE/d) foi cultivado a 37°C em caldo Luria-Bertani suplementado com 100 μg/mL de ampicilina até DO⁶⁰⁰=0,6-0,8, quando a expressão foi induzida com IPTG 0,5mM por mais 3h nas mesmas condições. O cultivo foi centrifugado (10.000xg; 10min; 4ºC) e suspendidos em tampão de lise. Essa suspensão foi sonicada, centrifugada novamente e o pellet suspenso em tampão contendo ureia 8M. A presença das proteínas nos diferentes tampões foi verificada por SDS-PAGE e Western blot (WB) utilizando anticorpo anti-His. Em seguida, as frações contendo cada proteína foram purificadas por cromatografia de afinidade em coluna de Ni⁺² Sepharose e analisadas por SDS-PAGE 12%. A proteína rC foi obtida dos corpos de inclusão, uma vez que apenas a suspensão com ureia 8M reagiu no WB. Contrariamente, a proteína rD se mostrou solúvel. Ambas apresentaram a massa molecular aparente esperada de 50 kDa, correspondente à Hc. Futuramente, a imunogenicidade dessas proteínas será avaliada em modelos animais.