Resumo

Phytomonas serpens é um tripanossomatídeo parasito de tomates que expressa moléculas similares às descritas em tripanossomatídeos patogênicos para humanos. Calpaínas (cisteína-peptidases neutras dependentes de cálcio) têm sido estudadas pelo nosso grupo nestes microrganismos, como em Trypanosoma cruzi e Leishmania amazonensis, como um novo alvo para o desenvolvimento de quimioterápicos. Para compreender as possíveis funções destas enzimas, foi selecionada uma população de P. serpens resistente ao inibidor de calpaínas MDL28170 na concentração de 70 µM, pelo cultivo destas células em concentrações crescentes da droga. A construção de uma curva comparativa entre as populações selvagem e resistente na presença da droga permitiu verificar um efeito dose-dependente sobre ambas as populações, sendo o IC50 calculado para a população selvagem de 37,03 µM, enquanto que para a resistente foi 121,67 µM. A análise por citometria de fluxo mostrou que a população resistente ao MDL28170 marcada com os anticorpos anti-Dm calpaína (Drosophila melanogaster), anti-gp63 e anti-cruzipaína apresentaram um aumento na expressão de homólogos destas moléculas. O estudo da atividade enzimática utilizando um substrato fluorogênico específico para calpaínas mostrou que a população selvagem apresentou uma grande atividade para a enzima, enquanto que na população resistente nenhuma atividade foi detectada. Uma população resistente cultivada na ausência da droga foi capaz de recuperar parcialmente a sua atividade enzimática. A análise por microscopia eletrônica de varredura e de transmissão mostrou que não há nenhuma diferença ultraestrutural entre essas duas populações. A análise da população selvagem tratada com o IC⁵⁰ da droga indicou fortes alterações na superfície das mesmas, bem como em organelas intracelulares, como o Complexo de Golgi e a mitocôndria. A análise proteômica inicial também permitiu observar diferenças no perfil proteico destas populações. Este estudo tem permitido verificar que há uma alteração no perfil proteico dessas populações, sem alterar a estrutura celular. Através da finalização da análise proteômica, pretendemos compreender melhor os mecanismos bioquímicos de resistência envolvidos, e assim compreender as possíveis funções de calpaínas no parasito. Apoio financeiro: CAPES, CNPq, FAPERJ, FIOCRUZ.