Resumo

A dengue é uma doença infecciosa febril aguda, de característica endêmica, causada por um arbovirus do gênero Flavivirus. Até o momento, foram descritos quatro sorotipos do vírus da dengue (DENV): DENV-1, 2, 3 e 4. A maioria dos pacientes infectados apresenta infecção assintomática, porém alguns indivíduos podem desenvolver a dengue clássica, a febre hemorrágica da dengue e a síndrome do choque da dengue. O diagnóstico laboratorial da dengue é realizado através do isolamento viral, da detecção do RNA viral e métodos imunológicos para antígeno NS1 e anticorpos IgM e IgG. O objetivo deste trabalho foi padronizar técnicas de hibridação de produtos da RT-PCR com sondas genéticas, desenhadas para os diferentes sorotipos do vírus da dengue, ligadas a diferentes suportes. Foram avaliadas 14 amostras clínicas de pacientes com suspeita de infecção pelo DENV e duas amostras de cultura de células de DENV-1 e DENV-2, uma amostra de soro de DENV-4 e uma negativa para dengue como controles. Um par de iniciadores comuns aos quatro sorotipos do DENV e um multiplex RT-PCR com iniciadores sorotipo-específicos para DENV foram avaliados. Cinco de 14 amostras foram amplificadas quando utilizados iniciadores genéticos comuns aos quatro sorotipos, apresentando uma banda de 511 pb, e identificados como DENV-4 por nested-PCR. Para hibridação, foi realizada uma RT-PCR onde obtivemos amplicons biotinilados. Estes iniciadores genéticos foram avaliados com três controles positivos (DENV-1, DENV-2 e DENV-4) e um controle negativo. Todos os controles positivos amplificaram, apresentando uma banda de 159 pb, comum aos três sorotipos do DENV testados. Os produtos obtidos na RT-PCR foram avaliados frente às sondas sorotipo-específicas complementares aos produtos da RT-PCR amplificados, previamente ligadas na membrana de nylon ou esferas magnéticas. Na hibridação em membrana de nylon, foram observadas bandas específicas após a reação de detecção. Empregando as esferas magnéticas contendo as sondas sorotipos específicas para DENV-2 e DENV-4 e utilizando a plataforma MAGPIX LUMINEX, foi possível identificar corretamente os sorotipos nas amostras controles e amostras clínicas. Neste trabalho, foi possível desenhar sondas específicas para os quatro sorotipos para um único fragmento de RNA do vírus Dengue e demonstrar que as mesmas podem ser utilizadas em ensaios de hibridação para a detecção desses sorotipos.