Resumo

O aumento das infecções fúngicas por espécies de Candida em consequência do número de pacientes imunocomprometidos, evidencia a importância de estudos relacionados a esse gênero. O DNA ribossomal (rDNA) é amplamente utilizado para a identificação de fungos, devido a presença de múltiplas cópias desse fragmento na célula, o qual aumenta a sensibilidade do ensaio. Na PCR em tempo real (qPCR), a análise da curva de melting é realizada após a amplificação das sequências-alvo com aquecimento gradual dos produtos da reação. Quando alcançada a temperatura de melting (Tm) ocorre a separação das fitas e redução drástica de fluorescência. Como cada fragmento de DNA tem uma Tm que depende da seqüência de nucleotídeos, comprimento do amplicon e quantidade de ligações C/G, o objetivo do trabalho foi avaliar a região do rDNA 18S para diferenciar as espécies de Candida com base na variação da Tm. As amostras de DNA de Candida spp. mais frequentemente isoladas no ambiente nosocomial (5 C. albicans, 10 C. parapsilosis e 5 C. tropicalis) foram extraídas pela metodologia fenol-clorofórmio. Foram utilizados para qPCR o corante SYBR Green, oligonucleotídeos iniciadores para rDNA 18S (5’-ATT GGA GGG CAA GTC TGG TG-3’ e 5’-CCG ATC CCT AGT CGG CAT AG-3’) e termociclador Bio-Rad iQ5. A diferenciação molecular foi realizada por comparação da Tm dos amplicons. Para a análise estatística foram realizados os testes D’Agostino-Pearson, ANOVA one way e Tukey para comparações múltiplas no software GraphPad Prism 5.0. Além dos picos correspondentes aos amplicons, também foi observado um pico inespecífico com temperatura inferior para todas as espécies. C. albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis obtiveram média e desvio padrão da Tm de 83,0±0,32°C, 83,5±0,16°C e 83,9±0,22°C, respectivamente, que demonstraram distinção entre os três grupos (p<0,001). Os picos inespecíficos da curva de melting é resultado de amplificação de outra região do amplicon diferente da alvo ou heterogeneidade dos produtos da reação. Os dados apresentados possibilitaram a diferenciação das espécies, no entanto, a região amplificada demonstrou limitação em consequência da baixa variação da Tm.