Resumo

Hemiceluloses que incluem &beta-glianas e xilanas são constituintes majoritários da parede celular vegetal, sendo a xilana o segundo polissacarídeo mais abundante da natureza. Endo-1,4-&beta-xilanases (EC 3.2.1.8) são responsáveis pela hidrólise das ligações &beta-1,4 presentes na cadeia interna da xilana. Estas enzimas tem sido foco de interessantes pesquisas pelo seu amplo espectro de aplicações em processos industriais importantes, tais como no pré-tratamento da polpa de papel e na bioconverção da biomassa lignocelulósica em biocombustível, por exemplo. O objeto de estudo deste trabalho é uma xilanase recombinante, presente no genoma do fungo termofílico, Thermoascus aurantiacus, produzida por clonagem e expressão heteróloga em Saccharomyces cerevisiae. Para tanto, o cassete de expressão foi transferido para o vetor epissomal de S. Cerevisiae, Y1PGK-1, um vetor bifuncional para expressão constitutiva em S. cerevisiae sob o controle do promotor do gene PGK1 com marca auxotrófica LEU2. O plasmídeo obtido (YPGK1xil) foi transformado pela técnica de choque térmico em células competentes de E. Coli (DH5-α), e co-transformado na cepa de S. cereviseae (CEN.PK2) para expressão heteróloga da endo-1,4-&beta-xilanase. Em seguida, os transformantes positivos foram selecionados por ensaio de atividade xilanolítica em placa com meio YNB/xilana sem leucina (0,67%; 0,5%), pH 5,5 e os halos de hidrólise revelados por coloração com congo red a 0,1% e descoloração com NaCl 1M. A colônia selecionada tem sido utilizada para ensaio de expressão constitutiva da enzima em meio líquido com YNB (0,67%) sem leucina, alterando fonte de carbono como glicose e xilana em diferentes concentrações, 0,5% a 1% e 1% a 2%, respectivamente, e a xilanase secretada utilizada para testes de caracterização funcional. No momento, o gene de xilanase foi clonado com sucesso, o transformante positivo para atividade xilanolítica selecionado e os ensaios de expressão em meio líquido estão sendo conduzidos para otimizar o nível de produção da enzima. Nesse sentido, as técnicas utilizadas de engenharia genética podem contribuir para a produção de uma enzima recombinante com características estruturais e, sobretudo, bioquímicas distintas da xilanase fúngica, aumentando o leque de aplicações industriais da mesma. Etapas posteriores envolvem a purificação e caracterização bioquímica e biofísica da enzima para comparação com os dados da xilanase fúngica produzida por fermentação submersa.