Resumo

Pseudallescheria boydii é um fungo saprófito filamentoso, pertencente ao Complexo Pseudallescheria/Scedosporium. Mesmo com o aumento do número de casos de pseudalescheriose, pouco se sabe sobre a bioquímica deste fungo. No entanto, é sabido que moléculas secretadas por fungos possuem propriedades antigênicas, bem como são capazes de induzirem danos a células hospedeiras infectadas. Sendo assim, o presente trabalho tem como objetivo verificar a existência de proteínas antigênicas secretadas pelo micélio de P. boydii e estudar o efeito citotóxico do sobrenadante sobre células epiteliais pulmonares do tipo A549. Para tal, o sobrenadante foi inoculado em coelho e um soro hiperimune foi obtido, denominado de anti-moléculas secretadas. Proteínas com massas moleculares variando de 115 a 20 kDa foram reconhecidas pelo soro através de Western blotting, bem como sua reatividade foi testada através de ELISA, apresentando reação positiva até uma diluição de 1:800. O mesmo soro foi utilizado para detectar a presença das moléculas antigênicas nos dois estágios morfológicos do fungo através de microscopia de fluorescência, bem como foi utilizado para localizá-las no micélio deste fungo através de imunocitoquímica, evidenciando que essas moléculas se situam majoritariamente na periferia da célula, principalmente ao longo da parede celular. Em paralelo, as A549 foram incubadas por 24 horas com o sobrenadante em diferentes concentrações, determinando através da técnica de incorporação do corante vital Vermelho Neutro, que a concentração citotóxica para 50% das células em cultura é de 2,2µg/µl. Foi evidenciado também o efeito citopático do sobrenadante por microscopia óptica e microscopia eletrônica de varredura e transmissão, onde foram observadas severas alterações morfológicas de suas estruturas. Alterações metabólicas foram identificadas após 24 horas de tratamento com 3,0µg/µl do sobrenadante, através da técnica de incorporação do sal de tetrazólio, enquanto que danos na membrana celular não foram evidenciados nessa mesma concentração e tempo através da dosagem da enzima lactato desidrogenase e pela marcação com Iodeto de Propídeo, o que nos faz presumir que o sobrenadante leva as células animais à morte por apoptose. Em suma, nossos resultados constataram que o micélio de P. boydii secreta diversas moléculas antigênicas para o meio extracelular e que o sobrenadante de cultivo é capaz de causar efeitos citotóxicos e citopáticos em células hospedeiras.