Resumo

Genes repórter são usados como proteínas fusionadas a regiões regulatórias de genes de interesse para visualização de sua expressão ou atividade. Os genes repórter tradicionais baseados na GFP são dependentes de oxigênio, o que impede sua utilização em sistemas anaeróbios. As proteínas fluorescentes derivadas de mononucleotídeos de flavina (FbFP) foram desenvolvidas para superarem essa restrição e podem ser utilizadas tanto em aerobiose quanto em anaerobiose, como em estudos com o gênero Bacteroides spp. A espécie B. fragilis tem se destacado por sua importância clínica e a expressão de importantes fatores de virulência. Dentre esses determinantes patogênicos, mecanismos de aquisição de ferro têm se destacado, especialmente aqueles envolvidos na degradação de radicais livres de oxigênio. O íon férrico é estocado em estruturas chamadas bacterioferritinas (Bfr), as quais podem proteger a bactéria do excesso livre deste íon. O objetivo deste trabalho é padronizar um protocolo de estudo utilizando a proteína BS2 como gene repórter na expressão de Bfr em B. fragilis. Nesse trabalho, o plasmídeo pGem – T easy® carreando o gene da proteína BS2 foi digerido com as enzimas de restrição SacI e BamHI, clonado em um plasmídeo induzível por maltose e oxigênio pFD1045 em E. coli e transferido para B. fragilis por conjugação triparental, onde foram selecionados pela expressão de resistência à eritromicina. As colônias selecionadas foram, então, expostas ao oxigênio e maltose e, em seguida, analisadas por microscopia confocal, para observação se haveria o mesmo nível de expressão do gene repórter nas duas diferentes situações. Após esses resultados, a expressão e regulação do gene bfr de B. fragilis (BF1214) foi analisada. A região de 208 pares de base a montante do gene bfr, que contém o promotor de B. fragilis já descrito na literatura, foi clonado in tandem com o gene bs2 dentro do plasmídeo pFD288. O plasmídeo não possui uma região regulatória e a expressão da BS2 é controlada pelo promotor do gene bfr. Desta forma, poderemos observar a influência de fatores ambientais sobre o gene, especialmente em relação à disponibilidade de ferro, na sua expressão.