Resumo

As atividades antropogênicas tem causado a contaminação dos solos com metais pesados, o que afeta negativamente a produção de culturas agrícolas de importância econômica. Ao longo da evolução, os micro-organismos desenvolveram vários mecanismos de resistência, visando diminuir a toxicidade causada pelo excesso de metal, um exemplo disso são os transportadores de efluxo, que atuam detoxificando a célula. A bactéria Gluconacetobacter diazotrophicus já foi descrita como resistente aos metais pesados cádmio, cobalto e zinco, sugerindo sua utilização em processos de biorremediação. Além disso, por apresentar características de promoção do crescimento vegetal, pode ser um bioinoculante mais eficiente em áreas contaminadas por metais pesados. Entretanto, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares envolvidos na resistência a metais pesados em G. diazotrophicus. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o papel dos transportadores de efluxo na resistência de G. diazotrophicus PAl 5 aos metais cádmio, cobalto e zinco. Para isso, uma biblioteca de 2227 mutantes de inserção por transposon Tn5 foi cultivada em meio LGI-m suplementado com 0,5 mM de CdCl2.H2O, 10 mM de CoCl2.6H2O ou 2,0 mM de ZnCl2. Um total de 134 mutantes tiveram o crescimento afetado negativamente quando submetidos a altas concentrações de Cd, Co, e/ou Zn. O DNA genômico dos mutantes sensíveis aos metais foi isolado e posteriormente digerido com EcoRI. As regiões flanqueadoras do transposon foram recuperadas por auto-ligação do produto da digestão, seguido de transformação em células competentes de Escherichia coli (pir-). O DNA dos transformantes foi isolado e sequenciado, identificando os mutantes ΔczcA, ΔczcC, ΔzitB, Δfief, ΔmdtC. Os genes czcA e czcC são responsáveis por codificar bombas de efluxo de metal, assim como zitB, que atua no efluxo de zinco e fief, que participa da extrusão de ferro. Já mdtC é responsável por codificar uma proteína envolvida com resistência a multidrogas. Com isso, os mutantes ΔczcA e ΔczcC apresentaram sensibilidade aos três metais testados, ΔzitB se mostrou sensível a cobalto e zinco, Δfief a zinco e ΔmdtC a cádmio. O papel essencial da proteína CzcA na resistência aos metais pesados cádmio, cobalto e zinco já foi relatado. Nossos resultados revelam que as proteínas de transporte ZitB, CzcC, Fief e MdtC também são importantes para a resistência a metais pesados na bactéria. Deste modo, G. diazotrophicus pode ser utilizada para prospecção de genes, visando o aumento da resistência de outros organismos de interesse. A identificação desses transportadores abre ainda perspectivas para a caracterização de novos mecanismos de detoxificação em G. diazotrophicus na resistência a estresses abióticos. Suporte financeiro: CAPES, CNPq, FAPERJ e INCT-FBN.