Resumo

Pichia pastoris recombinante es un eficiente sistema de expresión para la producción de proteínas heterólogas, sin embargo las condiciones de cultivo, temperatura y concentración de metanol, pueden afectar al crecimiento y sobrevida celular, así como a la producción de proteínas heterólogas. El metanol se utiliza como inductor de la expresión de proteínas y produce especies reactivas de oxígeno (ROS). Por lo anterior es necesario determinar cómo influye la temperatura y el metanol sobre la generación de ROS, daño oxidativo y viabilidad celular. El objetivo de este trabajo es determinar el efecto del metanol y la temperatura sobre la generación de ROS intracelular (peróxido de hidrógeno H2O2), peroxidación de lípidos de membrana y sobre la viabilidad celular de Pichia pastoris recombinante. Se realizaron 7 cultivos por triplicado en las siguientes condiciones: 14°C – 1% (v/v) Metanol (M); 14°C – 3% M; 22°C – 2% M (3); 30°C–1% M y 30°C – 3% M. El peróxido de hidrógeno intracelular (H2O2) fue evaluado a través de citometría de flujo, utilizando la sonda 2´, 7´ Diclorodihidrofluoresceína Diacetato (DCFHDA). El daño oxidativo de las membranas fue evaluado por espectrofotometría mediante la medición de las especies reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS) y la viabilidad celular fue evaluada por citometría de flujo utilizando la sonda Yoduro de propidio (PI). Se observó que Pichia pastoris recombinante cultivada a mayor temperatura (30°C) incrementó la generación de H2O2. Pichia pastoris recombinante cultivada a bajas temperaturas (10°C) presentó menores niveles de peroxidación lipídica que levaduras cultivadas a mayor temperatura (30°C y 1% Metanol). Mientras que el cultivo que presentó la mayor viabilidad correspondió a 14°C y 1% Metanol. Nuestros resultados sugieren que la exposición a 30°C induce un incremento en la generación de H2O2 y en el daño oxidativo en membranas celulares, esto afecta negativamente a la sobrevida celular de Pichia pastoris recombinante. Mientras que el aumento de la concentración de metanol en cultivos a 14°C también disminuye la viabilidad celular.