Resumo

Pichia pastoris es un sistema económico, rápido y eficaz para la expresión de proteínas heterólogas, necesitándose a nivel industrial un mayor rendimiento y productividad. Cabe destacar que cada condición de cultivo afecta tanto el metabolismo como la producción del producto de interés, para lo cual se hace necesario el estudio de las proteínas endógenas de la levadura. Un paso esencial para iniciar el estudio y que se asocia con la alta calidad de los datos y con el tiempo de investigación, es el rompimiento de la membrana y pared celular de la levadura. Por esta razón, un método de lisado óptimo permitiría aumentar la calidad y cantidad de muestras analizadas, además de mejorar el rendimiento relacionado a la cuantificación de proteínas. Para llevar a cabo el estudio se realizó un cultivo a 30ºC y 3% de metanol por un total de 72h. Se analizaron 5 métodos de lisis celular para romper la pared celular de la levadura, siendo éstos métodos de tipo enzimático, químicos y mecánicos. El método enzimático correspondió a la enzima zimoliasa; dos métodos químicos, buffer de lisis y buffer de extracción; y dos métodos mecánicos, ultrasonicación y sonicación. Se realizó la medición de la concentración de proteínas de la levadura a través del método de Bradford; además se realizó la medición de la densidad óptica a 600 nm de cada una de las muestras. Se analizaron 17 combinaciones generadas entre los cinco métodos de lisado con características diferentes. De acuerdo a los resultados analizados, se seleccionó el método de lisado compuesto por zimoliasa junto con buffer de extracción porque presentaron la mayor concentración de proteínas, dos veces mayor al del siguiente método con alta concentración de proteínas. En cuanto a la determinación de la densidad óptica en cada una de las muestras después de haber sido lisadas, más que ser considerado un patrón de selección, fue considerado como un patrón de confirmación de la selección realizada anteriormente. Esta selección es comprobada por el análisis de correlación de Pearson que indicaría que no existe una relación lineal entre ambas variables (R=0,06601). En conclusión, los métodos mecánicos seleccionados no serían beneficiosos para lograr finalmente un análisis de proteínas porque lisarían la levadura pero a la vez dañarían las biomoléculas de ésta, impidiendo realizar los posteriores análisis.