Resumo

O Transplante de órgãos e tecidos é uma opção terapêutica para pacientes com enfermidades graves e em fase terminal. Entretanto, a frequente debilidade do paciente e a imunossupressão favorecem infecções virais oportunistas ou reativação de infecções latentes que aumentam o risco de complicações e de rejeição do enxerto. A infecção pelo Herpes simplex virus 2 (HSV-2) apresenta manifestações clínicas severas como a encefalite herpética e pode levar à rejeição do enxerto. O difícil diagnóstico sorológico, a imprecisão na determinação de partículas virais viáveis e infecciosas por técnicas moleculares, a resistência e toxicidade dos fármacos antivirais e a gravidade e a cronicidade da infecção podem culminar no insucesso do transplante. O objetivo deste trabalho é desenvolver um sistema celular para o HSV-2 utilizando o gene da proteína GFP (Green Fluorescent protein) como repórter. O sistema foi construído por inserção do vetor ZsGreen associado a região promotora do gene da Ribonucleotídeo Redutase (ICP10) do HSV-2 em células Vero. A região promotora foi isolada por PCR através do uso de iniciadores específicos. A digestão dos produtos foi realizada com as enzimas BamHI e EcoRI para clonagem direcional no vetor. As células foram cultivadas em DMEM (Meio Eagle’s modificado por Dulbecco’s) suplementado com soro fetal bovino, a transfecção efetuada com lipofectamina (Xfect™ Trasfection Reagent) e as células selecionadas com geneticin (G418). Finalizada a seleção foram preparadas placas de 24 cavidades contendo 0,8 x 10⁵ células/mL, as quais foram infectadas 24 horas após com HSV-2 (Cepa 333) (100, 200, 400 UFP/mL). A incubação ocorreu a 37°C e 5% de CO₂ até o momento da avaliação da expressão da fluorescência. Células fluorescentes resultantes da indução do sistema puderam ser observadas por microscopia de fluorescência e a indução confirmada por associação ao efeito citopático viral. Utilizando citometria de fluxo, 48 h após a infecção, pode-se observar um aumento da fluorescência média, correspondente ao aumento da multiplicidade de infecção viral de até 49% em relação aos controles. Os resultados indicam que o sistema repórter foi induzido pelo HSV-2 sendo possível o aperfeiçoamento do mesmo para emprego na clínica. Este modelo proporcionará a ampliação do conhecimento sobre o HSV-2 e poderá ser aplicado no desenvolvimento de novos fármacos, uso em diagnóstico e monitoramento clínico laboratorial e na análise de resistência a antivirais.