Resumo

A Linfadenite Caseosa (LC) é uma doença crônica causada por bactérias Gram-positivas da espécie Corynebacterium pseudotuberculosis acometendo principalmente pequenos ruminantes. Essa enfermidade caracteriza-se pelo desenvolvimento de abscessos em linfonodos superficiais e/ou viscerais, sendo responsável por perdas econômicas significativas mundialmente. Apesar das intensas pesquisas laboratoriais, os métodos diagnósticos desenvolvidos demonstraram pouca eficiência na identificação de animais acometidos na fase subclínica da doença. Atualmente, não há relatos na literatura de testes Imunocromatográficos rápidos para a LC, embora sejam amplamente utilizados para diagnosticar doenças bacterianas, virais, fúngicas e parasitárias. Da mesma forma, não existem estudos aprofundados sobre caracterização de antígenos a serem utilizados nestes testes. Possíveis candidatos têm sido descritos na literatura, como algumas proteínas secretadas totais (PSTs) de C. pseudotuberculosis que demonstraram antigenicidade após ELISA e Western Blot com soros de animais infectados, induziram elevada produção de interferon-gama (IFN-Γ) por células sanguíneas, além de serem identificadas por espectrometria de massa e caracterizadas por análises in silico. Dessa forma, neste trabalho selecionamos os melhores alvos protéicos previamente caracterizados e produzimos as proteínas recombinantes para a elaboração de um teste imunocromatográfico rápido para a LC. Três alvos gênicos foram selecionados após análises envolvendo a densidade de epítopos de seus produtos, além de resultados obtidos em testes imunoproetômicos. Os insertos foram amplificados após a extração do DNA genômico da linhagem 1002 de C. pseudotuberculosis com a utilização de iniciadores específicos, ligados no vetor pET-28a(+) e transformados em Escherichia coli TOP10 para a clonagem molecular. Para verificar a expressão das proteínas recombinantes, os clones foram transformados em E. coli C43 pLysS. Após a indução com 1mM de IPTG, as proteínas recombinantes foram purificadas através da técnica de cromatografia por afinidade e caracterizadas quanto à antigenicidade por meio de ensaios de ELISA, Western blot e dosagem de IFN-Γ. Concluídas essas etapas, esperamos que uma ou mais proteínas recombinantes possam ser utilizadas no desenvolvimento de um teste imunocromatográfico rápido de elevada acurácia, para a aplicação no controle da disseminação da doença nos rebanhos de ovinos e caprinos.