Resumo

Salmonella spp. causa infecções alimentares de extrema relevância e acarreta importantes perdas econômicas à indústria de alimentos. O método padrão de detecção em alimentos é laborioso e dispendioso, exigindo um longo tempo de análise. Imunoensaios que utilizam anticorpos para a detecção rápida do patógeno tem sido desenvolvidos. Neste trabalho é descrita a clonagem do gene invH, que codifica um antígeno de invasão específico de salmonelas, em vetor de expressão em procarioto, visando o uso posterior da proteína recombinante na imunização dos animais para obtenção de anticorpos. Assim, oligonucleotídeos iniciadores foram desenhados a partir da sequência do gene invH depositada no GenBank. O gene foi amplificado por PCR a partir do DNA total de S. Typhimurium. Após, o amplicon foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e EcoRI e ligado ao vetor pAE. E. coli TOP10 foi transformada por choque térmico com o produto da ligação, e os clones recombinantes foram selecionados em ágar LB contendo ampicilina. Para a extração e purificação do DNA plasmidial utilizou-se o kit GFX Micro Plasmid Prep (GE). Para avaliar o sucesso da clonagem, o vetor pAE/invH foi digerido com as mesmas enzimas de restrição usadas na construção (sendo os produtos da digestão visualizados em gel de agarose 0,8%) e utilizado como DNA molde em PCR e sequenciamento. Cepas de E. coli BL21(DE3) pLysS e Star foram transformadas com pAE/invH visando a expressão da proteína recombinante. Os clones recombinantes selecionados foram cultivados em caldo LB contendo ampicilina e/ou cloranfenicol, de acordo com a cepa avaliada, sob agitação (37°C/ 200rpm), até a fase log de crescimento. Induziu-se a expressão com 0,5 mM de IPTG, e três horas após a indução, um mililitro da cultura foi coletado, centrifugado e submetido à SDS-PAGE a 15%, sendo a expressão da rInvH confirmada por Western blot utillizando anticorpo anti His-tag. A caracterização do plasmídeo pAE/invH por digestão, PCR e sequenciamento demonstrou a orientação correta do inserto. No Western blot, uma banda de aproximadamente 17 kDa, correspondente à rInvH, foi observada nas duas cepas de expressão avaliadas.. Concluiu-se que o plasmídeo pAE/invH foi clonado com sucesso. A proteína rInvH expressa será utilizada na imunização de camundongos visando à produção de anticorpos poli e/ou monoclonais.