Resumo

Introdução e objetivo: A levedura Pichia pastoris oferece vantagens para expressão de proteínas heterólogas quando comparada a sistemas de expressão em procariotos: alto crescimento em meios de cultivo simples, capacidade de realizar modificações pós-traducionais e de secretar as proteínas de forma solúvel no meio e presença de um forte promotor induzível por metanol. Essa levedura tem sido utilizada com sucesso para a expressão de várias proteínas heterólogas sendo que diversos vetores já foram desenvolvidos para este sistema. Os principais vetores de expressão de P. pastoris são baseados no promotor do gene AOX que codifica a enzima álcool oxidase 1. Neste trabalho avaliamos o tempo de indução na produção de fragmento de anticorpo scFv, variando o tempo de indução de 28 para 32 horas, foram avaliadas também duas concentrações de indutor (metanol), 1 e 1,5%, além disso, foi investigado três diferentes temperaturas de indução: 10, 20 e 30°C. A condição de 1% de indutor, 20°C e 28 horas foi denominada de cultivo referência. Todas as condições de cultivo foram realizadas com um kLa de 96,12h-1. Resultados e discussão: Os resultados obtidos foram discutidos com base na produção do fragmento do anticorpo scFv. Pode-se observar que o aumento no tempo de indução de 28 horas (a 20°C) para 32 horas (a 10°C) reduziu a concentração da produção de fragmento de anticorpo scFv, de 14,5 para 6,1 mg/L, respectivamente. Paralelamente, observou-se que essa última condição (32 horas/10°C/concentração de indutor de 1,5%) apresentou duas vezes menos produção de fragmento de anticorpo scFv em relação à primeira condição. Por outro lado, quando estudou-se a condição de cultivo com 32 horas/30°C/concentração de indutor de 1,5%, não foi observada influência na produção do fragmento de anticorpo de scFc (14,5 mg/L) mantendo a mesma produção quando comparada com o primeiro cultivo (referência, 14,5 mg/L). Conclusão: O efeito do aumento da temperatura (30°C) relacionada com a concentração de indutor influencia positivamente a produção de fragmento de anticorpo scFv, isso pode estar relacionado com a evaporação do metanol no meio de cultivo, ou seja, a concentração de metanol é reduzida e, portanto, deve diminuir a repressão catabólica pelo promotor AOX. Estudos nesse sentido, com o intuito de avaliar o efeito desse fenômeno serão realizados por cromatografia gasosa em ensaios futuros.